"Noc w muzeum" to parodia filmów grozy. Larry Daley (Ben Stiller) jest strażnikiem, pracującym na nocnej zmianie w Muzeum Historii Naturalnej. Bez przerwy prześladuje go pech, zarówno w pracy, jak i poza nią. Podczas jednego z dyżurów, nasz bohater nieświadomie uwalnia magiczną moc, tkwiącą w jednym ze starożytnych eksponatów. Po czym nagle w muzeum rozpętuje się prawdziwy chaos. Wypchane zwierzęta i figury historycznych postaci ożywają, a namalowane na obrazach sceny bitew przenoszą się do rzeczywistości. Wódz Hunów - Attyla - rozgląda się, jaki kraj by tu podbić, neandertalczycy w poszukiwaniu ognia puszczają z dymem pół sali, a na domiar złego T-Rex rusza na polowanie. Jedyną osobą, która może pomóc biednemu strażnikowi w opanowaniu tego bałaganu, jest były prezydent USA - Teddy Roosevelt (Robin Williams).